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【2014诺贝尔化学奖深入报导】 打破光学显微镜的解析度极限

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【2014諾貝爾化學獎深入報導】 打破光學顯微鏡的解析度極限-超高解析螢光顯微法

今年的诺贝尔化学奖颁给了由 Stefan Hell, William Moerner 和 Eric Betzig 所开发的超高解析萤光显微法。所谓的超高解析萤光显微法,就是能打破光的绕射极限(图一)的显微镜技术。

得奖的显微法有两种:受激放射消去显微法STED (STimulated Emission Depletion) Microscopy光启动定位显微法PALM (PhotoActivated Localisation Microscopy)。这两种方法是完全独立被开发出来的方法,现今多应用在生物研究上。

【2014诺贝尔化学奖深入报导】 打破光学显微镜的解析度极限

图一
图片来源:
http://www.microscopyu.com/articles/superresolution/diffractionbarrier.html

【图一】假设由样本发出的光视同于由点光源(Point Source)发出的光,当这些光线经过显微镜物镜时会与物镜孔洞(Objective Aperture)的边缘产生绕射。这些绕射的光在共轭面上会产生相长干涉(图中红线)及相消干涉(图中绿线),造成呈像面(Image Plane)面上的影像不再是一个点而是一个被称为光晕盘(Airy Disc)的干涉图样 。这也是为什幺光的聚焦永远无法小于其波长除以2倍数值孔径大小。图a与图b则清楚呈现了不同的物镜数值孔径(NA)如何影响呈像面上干涉图样(意即光学解析度)的大小。

以下将简略地介绍为这三人摘下诺贝尔奖桂冠的研究。技术与理论的细节会放在各图的图解中,有兴趣者请细读图解。

受激放射消去显微法: STED (STimulated Emission Depletion) Microscopy

此技术由理论1,2到实做3的基础都是由 Stefan Hell 所确立的。这三篇论文也为他赢得了这次诺贝尔化学奖的殊荣。「受激放射消去显微法」採用与一般高解析度的共轭焦显微镜类似的聚焦扫瞄呈像方式。这个技术的核心概念是:假设一道光的聚焦永远无法突破绕射极限,那就用两道不同的光令其与萤光标誌交互作用而达成超高解析度的目标。

这两道光中,其中一道以平常手法聚焦的激发光用以激发萤光分子、另一道聚焦为甜甜圈图案的抑制光则用以抑制除了甜甜圈中心之外所有被激发的萤光分子发光(图二)。

【2014诺贝尔化学奖深入报导】 打破光学显微镜的解析度极限

图二 (图片来源:图a,b取自参考文献3, 图c取自参考文献4)

【图二】受激放射消去显微法的运作原理。图a是受激放射消去显微法的实验装置图解。绿色路径为激发萤光色素用的光路(Excitation)、红色路径则为用以抑制在外围的被激发萤光分子发光的光路(STED)。图b为激发光(绿)及抑制光(红)在焦点平面上于XZ平面的图示。为了产生图b中红光的中空焦点,图a红光路径的半波片(λ/2 Phaseplate)中心有镀上一层光遮罩。图c中上列的图示是说明受激放射消去显微法如何增强XY平面上的光学解析度。下列图示则是说明其如何增强XZ平面上的光学解析度。此图中的蓝光为激发光(Exc.)、橘光为抑制光(STED)、绿光则为实际可侦测到的萤光(Eff. Spot)。图中公式为受激放射消去显微法理论上的解析度极限。分母中的 I 为实际入射所使用的抑制光的强度,Is为成功抑制萤光所需的抑制光强度。也就是说,若实际入射光无限大,则此系统的所能解析的物质大小则趋近于零,意即解析度无限大。

当甜甜圈图案中心的孔洞小于绕射极限时,也就是说只有小于绕射极限範围的萤光分子能够正常发光时,其呈现地影像将超越绕射极限的影像解析度。至于抑制被激发萤光分子发光的方法,在Stefan Hell初期的研究里是利用受激放射消去的原理(图三),也是这个方法得名的由来。由于这个手法的理论解析度趋近于无限大(图二公式),并且理论上可以适用于任何已知的萤光标誌上,因此发表后很快地便获得了极大的注目。近年来,为了解决这个手法一直以来最被垢病的问题:强烈的抑制光所造成的样本损伤;许多使用不同萤光消去原理的同类型装置纷纷被开发4(主要着力在可用微弱光线即关闭其发光机制的新型萤光标誌分子的研究),也让人十分期待这个技术未来能有如何的应用及发展。

【2014诺贝尔化学奖深入报导】 打破光学显微镜的解析度极限

图三(图片来源:图取自Stefan Hell实验室网页http://www3.mpibpc.mpg.de/groups/hell/STED.htm)

 【图三】受激放射消去的原理。一个萤光物质在吸收(Absorption)了特定高能波长的光线后,其原本位于S0电子基态的分子构造会被激发到S1第一电子激发态。此时若什幺都不做,其能阶将会释放使其分子构造回到S0电子基态,同时发出萤光(Fluorescence)。不过在电子态被激发时,若同时打入一道受激放射光,则原本位于S1第一电子激发态的分子会受激放射(Stimulated Emission),即释出与受激放射光同样能量的光线并回到S0电子基态的某个特定振动能阶(此原理与雷射发光是相同的)。此时若观察与受激放射光不同波长的萤光放射区段则无法看到萤光发光,因而达到抑制发光的效果。

光启动定位显微法:PALM (PhotoActivated Localisation Microscopy)

「光启动定位显微法」是一种一次观测单一萤光分子的显微法。此技术的理论5及实做6都由 Eric Betzig 完成。不过由于此类单分子观测技术是由William Moerner开先河7,再加上他对单一绿色萤光蛋白分子的研究直接影响了「光启动定位显微法」的实践8,因此这四篇论文让这两人与Stefan Hell共同分享了今年的诺贝尔化学奖。此技术直接放弃聚焦扫瞄的呈像方式,改用全面照明的系统架构。此呈像手法的关键在于须要被光启动之后才会发光的萤光标誌分子。其运作原理是:既然已知聚焦光无法分辨相距在绕射极限範围内的两个萤光标誌,那就改利用光启动的方法让相距在绕射极限範围内的萤光标誌分开发光,之后逐一启动及消去各个萤光标誌的发光能力,并一一标记各发光过的萤光标誌的位置,最后就能组成一个以单一发光分子为解析度的萤光图像9(图四)。早期,由于这个呈像方法需要不段重覆地点亮萤光标誌分子并待其光致褪色,此技术最为人所垢病地就是过慢的呈像速度以致其只能被应用于被固定的细胞上。为了改善这个窘境,许多科学家纷纷投入研究新式的可逆式光转换萤光分子(也就是可以光启动也可以光关闭的萤光分子),也使得光启动定位显微法的呈像速度越来越快,现在甚至已可用来观测活细胞中单一被标誌分子的动态10。

【2014诺贝尔化学奖深入报导】 打破光学显微镜的解析度极限

图四 (图片来源:图取自参考文献9)

【图四】光启动定位显微法的运作原理。现假设有一个间隔远小于绕射极限、并由许多萤光标誌分子所标记、如同右上角图t的橘色同心圆图样的图形。由于其圆与圆之间的间隔远小于绕射极限,此时若是用一般的光学显微法观测此样本,其呈现出来的影像会是同于图s般的白色图样般的圆盘。要以光启动定位显微法观测此图形的细微构造,其前题是必须要使用特殊、须要被光启动后才能发光的萤光标誌分子标记此图形。首先,对被此种特殊萤光标誌所标记的样本开启激发萤光标誌分子用的激发光。这道激发光从头到尾都会保持持续开启的状态。此时由于尚未有任何萤光标誌分子被启动,因此视野内不会有任何萤光发出(图a, b)。

接下来,用非常微弱的启动光照射这个样本。这个启动光必须要弱到在成千上万的特殊萤光标誌中,只有少数的一两个会被随机启动。启动光的照射在此图中以紫灯表示。此时由于有极少数的特殊萤光标誌被启动了,在视野中可以看到零散地萤光分子发光了(图c)。在以高斯分布计算图c中每个光晕盘的中心位置之后,将其定位标记下来,製成如图d的图。接下来等图c中被激发的萤光分子被光致褪色(萤光分子被持续地激发所导致地永久性发光机制受损的现象总称)后,视野再度恢复如图e般暗淡。

不过由于被光致褪色的萤光标誌的定位已被纪录,图f仍保留的图d留下来的定位。之后再度照射启动光,又有其它尚未被光致褪色的萤光标誌被激发,视野再度呈现如图g的图样。将这些光晕盘再度定位后加到之前的定位纪录上,就会看到如图h、包含之前和此次测定所得到的定位标记的图。等这一轮的萤光标誌分子也被光致褪色后(图i),再度照射启动光,并持续纪录每轮所能标记到的定位,其定位标记图就会如图j, n, r一般渐渐呈现受标记图形的轮廓。最后当每一个分子都被光启动定位后,其全部的定位标记相加就能得到被标记样本的超高解析度影像(图t)。 

由以上的介绍,大概不难了解这两个超高解析萤光显微法现在的突破都要仰赖新式萤光分子的开发。这个由物理学家起头(Stefan Hell和Eric Betzig的本行都算是物理学者)的新领域现在要靠化学家做进一步突破,以期将来能够解决更多生物上的难题。如此跨学门的研究方向实属少见,也再再突显出此一新技术受到瞩目的程度!


参考文献

1.        Hell, S. W. & Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt. Lett. 19, 780 (1994).

2.        Hell, S. & Kroug, M. Ground-state-depletion fluorscence microscopy: A concept for breaking the diffraction resolution limit. Appl. Phys. B 60, 495–497 (1995).

3.        Klar, T. a., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, a. & Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proc. Natl. Acad. Sci. 97, 8206–8210 (2000).

4.        Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science 316, 1153–8 (2007).

5.        Betzig, E. Proposed method for molecular optical imaging. Opt. Lett. 20, 237 (1995).

6.        Betzig, E. et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science 313, 1642–5 (2006).

7.        Moerner, W. & Kador, L. Optical detection and spectroscopy of single molecules in a solid. Phys. Rev. Lett. 62, 2535–2538 (1989).

8.        Dickson, R., Cubitt, A., Tsien, R. & Moerner, W. On/off blinking and switching behaviour of single molecules of green fluorescent protein. Nature 388, 355–358 (1997).

9.        Gould, T. J., Verkhusha, V. V & Hess, S. T. Imaging biological structures with fluorescence photoactivation localization microscopy. Nat. Protoc. 4, 291–308 (2009).

10.      Sengupta, P., van Engelenburg, S. B. & Lippincott-Schwartz, J. Superresolution imaging of biological systems using photoactivated localization microscopy. Chem. Rev. 114, 3189–202 (2014).

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